I. MICROBIOLOGIE DES POISSONS :

1. MILIEU AQUATIQUE : Le milieu aquatique va conditionner de faà§on importante la microbiologie des poissons. En effet, les eaux peuvent être extrêmement polluées par les rejets humains et animaux et contenir donc des germes pathogènes ( Salmonella, Shigella, Vibrio, Clostridium perfringens,... ), des virus (bactériophages et entérovirus), et des parasites animaux et végétaux.

2. FLORE MICROBIENNE : La chair des poissons est riche en eau, histidine, iode, azote non protéique. phosphore, et vitamines A et D. Elle contient peu de glucide, calcium, et fer. La flore de ces produits est fortement influencée par celle du milieu aquatique. La chair des poissons est vulnérable. Les régions contaminées sont les branchies et le mucus qui recouvre la peau et le tube digestif.

3. ALTERATIONS MICROBIENNES : L’altération des poissons est due aux enzymes tissulaires et aux micro-organismes. Ces derniers jouent un rôle très important. Les facteurs qui conditionnent l’altération microbienne sont : * Variété de poisson : pH de la chair, richesse en graisses. * Habitat du poisson : type et étendue de la contamination bactérienne. * Conditions de pêche et de stockage ; Conditionnement en milieu aérobie ou anaérobie. Présence ou non d’un étêtagc et d’une éviscération qui, faits dans de mauvaises conditions, ont une1 grande incidence de contamination. Qualité micro biologique de la glace et des eaux de lavage. Température de stockage, etc. * contamination croisée entre amont et aval d’une chaà®ne de transformation.

Les altérations microbiennes proviennent de :

* la flore de surface.

* la flore intestinale : elle peut envahir les tissus après autolyse des viscères d’o๠l’intérêt d’une éviscération rapide. Les parasites et les bactéries pathogènes d’origine intestinale sont :

Salmonella, Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, plus rarement Shigella.

Les conséquences de l’altération microbienne sont : * mauvais goà»t, mauvaises odeurs, coloration ou décoloration, dégradation et surtout putréfaction des protéines et graisses.

* libération d’ammoniac et d’aminés comme la TMA (triméthylamine) qui peut être dosée par ABVT ( Azote Basique Volatil Total).

* production de H2S, diméthylsulfure, de méthyl mercaptan. Des aminés toxiques comme l’histamine peuvent être formées à partir d’acides aminés (ceci est fréquent chez certaines familles de poissons : Thonidés, Scombridés, Clupéidés).

II. ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DES POISSONS :

1. PRELEVEMENT : 1.1.Echantillonnage :

Le contrôle de la qualité et de la salubrité des poissons s’effectue par sondages. Par exemple, lorsqu’il s’agit de lots constitués de caisses, une caisse est examinée au hasard par 10 caisses. Pour un examen approfondi, un échantillon représentatif est prélevé au hasard sur le contenu des caisses retenues. En plus, on peut effectuer des prélèvements d’eau pour étudier le milieu aquatique.

1.2.Techniques de prélèvement et de conservation de l’échantillon : Le prélèvement peut être constitué par des éléments entiers : poissons. Les éléments choisis sont placés dans un emballage stérile dans les meilleures conditions d’asepsie possibles. D’autres techniques sont utilisables : prélèvement de surface, prélèvement de fragments, prélèvement des eaux. 1.2.2 ;, ;, les prélèvements doivent être transmis au laboratoire dans les meilleurs délais (moins de 24h) et à basse température ( 4°C). la réfrigération ,ie doit pas être obtenue par de la glace directement au contact des éléments prélevés : ils doivent être enfermés dans un sachet étanche aux liquides.

1.3.Traitement des échantillons : Les poissons ne subissent qu’exceptionnellement l’analyse micro biologique classique. Ils sont traités avec broyage et dilutions en eau peptonée tamponnée. Le plus souvent, ils sont soumis à un simple examen macroscopique qui permet de définir leur état de fraà®cheur et parfois à un prélèvement de surface.

2. TECHNIQUES D’ANALYSE :

2.1. Etude macroscopique : L’état de fraà®cheur est apprécié par l’étude des caractères macroscopiques et organoleptiques

* examen direct : Les caractères suivants sont contrôlés : Odeur, aspect général, rigidité, sécrétions, écailles, peau, œil, opercule, branchies, abdomen, anus, viscères, colonne vertébrale, chair. Un barème de cotation peut être appliqué à ces caractères : il permet de définir l’indice d’altération. Cet indice est égal à la moyenne arithmétique des notes attribuées aux différents caractères observés sur le poisson allant de 0 à 6. Cet indice influe sur les qualités sanitaires et marchandes des poissons. Dans les lieux d’expédition, les poissons destinés à la consommation doivent avoir un indice inférieur à 2,8. Dans les points de vente au détail, les poissons frais ou réfrigérés doivent avoir un indice inférieur à 3.

* Test de cuisson :

II permet de mieux détecter les odeurs anormales. Il est effectué selon l’une des méthodes suivantes :

Méthode officielle : Mettre dans un bain-marié 50g de chair avec 250ml d’eau pendant 10min. Laisser refroidir puis apprécier les odeurs.

Méthode rapide : Mettre dans une micro-onde 10g de chair pendant 30 secondes.

2.2.Etude de la flore globale : * Le dénombrement de la flore aérobie mésophile totale (FAMT) s’effectue par ensemencement sur un milieu PCA en boite de pétri pendant 2h à 30°C .

* Le dénombrement de la flore aérobie psychrophile pour les produits conservés au froid s’effectue pendant 10 jours à 5-8°C.

* Le dénombrement de la flore halophile pour les produits conservés par le sel s’effectue sur un milieu PCA additionné de 15% de chlorure de sodium.

2.3. Etude des germes de contamination fécale :

* Méthode classique de Mac Grady : consiste à calculer le nombre le plus probable (NPP) d’organismes.

* Méthode de Boury consiste à ensemencer deux séries de 1 tubes contenant un milieu à concentration adéquate, l’une par x ml de liquide à analyser par tube, l’autre par x/10 ml par tube, x étant choisi en fonction du degré de pollution du liquide à analyser. x = 5 ml permet de dénombrer de 0 à 2 000 germes/litre de suspension à analyser, x = 2 ml permet de dénombrer de 0 à 5 000 germes/litre, x = 1 ml permet de dénombrer de 0 à 10 000 germes/litre.

Le nombre de germes présents dans 1 litre d’eau de mer ou de suspension à analyser est donné par la lecture de la table de Boury.

Le nombre de tubes positifs est de 0 à 5 pour la série concentrée et pour la série au 1/10, on a donc 36 combinaisons pour lesquelles correspond un nombre probable de germes par litre.

Nombre de tubes positifs Série concentrée

0 1 2 3 4 5

Série au 1/10 0 0 40 80 120 160 200

1 36 80 130 180 240 400

2 70 120 180 260 370 800

3 110 170 240 340 500 1200

4 150 210 300 420 650 1600

5 180 260 350 500 750 2000

Table de Boury pour les séries 5 et 0.5 ml.

Le procédé de Vincent (de moins en moins utilisé) permet de dénombrer Escherichia coli de manière assez spécifique.

La méthode au bouillon lactose avec cloche (la plus courante) permet la numération présomptive des coliformes. La méthode au BLBVB avec cloche (la plus fréquemment utilisée)consiste à :
 Broyage et dilution à l’eau peptonnée tamponnée.
 Incubation 30 à 45min à température ambiante.
 Ensemencement des milieux. Si la numération est effectuée par la méthode classique(de Mac Grady) : 3 séries de 3 tubes de BLBVB reà§oivent respectivement 1ml des dilutions à 1/10, 1/100 et 1/1000 de la suspension mère. Si la numération est effectuée par la méthode de Boury : Les tubes de BLBVB reà§oivent de 5 à O.lml d’inoculum, complété à 5ml par de l’eau salée. Les milieux BLBVB sont incubés pendant 24 à 48h à 37°C. Les tubes avec gaz indiquent la présence de coliformes. Ils sont soumis au test de Mackenzy pour la caractérisation des E.Coli. Ils ^nt recherchés par culture présomptive sur milieu de Rothe après 48h d’incubation à 37 °C.

* Dans la méthode classique :

3 séries de 3 tubes reà§oivent 1ml des dilutions à 1/10, 1/100, et 1/1000 de la suspension mère. Les tubes sont repiqués sur des tubes de milieu de Litzky, qui sont incubés pendant 24 à 48h à 44°C.

* Dans ia méthode de Boury : On utilise du milieu à double concentration qu’on ensemence selon la méthode de Vincent. Ils sont dénombrés sur milieu de Wilson Blair. Un chauffage de la suspension mère est réalisé à 800°C pendant 5min.
 Les formes sporulées sont sélectionnées. Plusieurs tubes de milieu de surfusion reà§oivent respectivement 1 Oml, 5ml, et Sfois 1ml de cette suspension. L’incubation dure 24h à 37°C.
 Les colonies noirs sont dénombrés.

2.4.Recherche des germes pathogènes :

 Recherche de Salmonella :
 Pré-enrichissement : incuber 6h à 37°C un mélange de 25ml de broyât + 100ml d’eau peptonée tamponnée.
 Enrichissement et isolement : ensemencer à l’aide de 25ml de ce mélange. 225ml de milieu d’enrichissement (milieu au sélénite). Après 24h d’incubation à 37°C, les Salmonella sont recherchés en milieu gélose.

 Identification biochimique et sérologique. * Recherche de Shigella : Cette recherche n’est pas envisagée en raison de la faible survie de ces germes dans l’eau de mer.
 Enrichissement : incubation 6h à 37°à‡ d’un broyât à l’aide d’eau peptonée alcaline ou de milieu de Wilson Blair.
 Isolement sur gélose nutritive additionnée de 1% de taurocholate de sodium. (Incubation pendant 24 à 48h à 37°C).

2.5.Recherches complémentaires : Ces études sont importantes dans le cas des poissons frais ou conservés, car elles permettent d’apprécier l’altération d’origine microbienne sur ces produits o๠l’analyse micro biologique classique n’est effectuée qu’exceptionnellement. La TMA (triméthylamine) est produite par les bactéries en anaérobiose. On la dose généralement en même temps que l’ABVT par CPG. La valeur brute de TMA est difficilement interprétable, par contre, le rapport P=TMA/ABVT en % est plus significatif et constitue un bon indicateur de fraà®cheur. Cette base qui provient de la décarboxylation de l’histidine est à l’origine à®’intoxications caractéristiques se traduisant par des troubles circulatoires digestifs, ou de type allergique. J/histamine se trouve en quantité importante dans certains types de poissons (sardine, chon) et son taux augmente dans le cas de fortes altérations d’origine niiciobienne. La recherche de l’histamine s’effectue par :
 Préparation d’un broyât de 1g de chair avec 5 ml de sérum physiologique dans un mortier, puis séparation du liquide d’extraction par centrifiigation.

 La mise en évidence peut aussi se faire par chromatographie en couche mince ou par HPLC.

 Il existe aussi des techniques de dosage enzymatique ou immunoenzymatique ELISA.

 On réalise le dosage sur 9 échantillons : la teneur moyenne doit être à 100 mg/kg.

La cadavérine (issue de la lysine) et d’autres aminés : putrescine, spermidine, spermine (issues de l’arginine), tyramine, dopamine, noradrénaline (issues de la tyrosine),etc peuvent être dosées par HPLC en utilisant les techniques décrites pour l’histamine. Ces produits ont une toxicité propre et peuvent également participer à la formation de nitrosamines. L’indice de Karmas : (his+putr+cadav)/(l+sperm+spermid) permet de quantifier le danger présenté par les aminés dans les poissons. on peut effectuer :

* Recherche des toxines diarrhéiques d’algues par HPLC.

Recherche des toxines paralysantes par extraction par spectrofluorométrie et/ou HPLC. Détection des toxines paralysantes d’algues par action sur des cultures de tissus en présence de colorant vital (rouge neutre) sur microplaque ou par HPLC ou par immunodosage. III. PRODUITS DERIVES :

l.Surimi : C’est un produit fabriqué à partir de pulpe de poisson crue. l.Paissons saies : La salaison est une déshydratation partielle du poisson par le sel (Anchois).

3. Poissons sèches : Le séchage s’effectue dans une halle o๠l’on fait circuler du courant d’air. Le poisson peut aussi être séché par une grande chaleur qui entraà®ne l’évaporation rapide de l’eau (morue, hareng).

4.Poissons fumés :

Le poisson est exposé à la fumée de combustion partielle de certains types de bois, (filet de hareng, filet de saumon, filet de maquereaux).

5.P xiuits marines et saumurés : Ces produits subissent un séjour dans un bain de saumure ou vinaigre, (hareng mariné au vinaigre, crevettes décortiquées en sauiiure, moules).